سوال؟

[ABAN dokht]

بیولوژی Biology:
سوال: RNA به اندازه کافی وجود دارد اما در واکنش پایین دست (اینجا RT-PCR) جواب دلخواه به دست نمی آید. علت چیست؟
جواب:
آیا واکنش سنتز رشته اول cDNA موفقیت آمیز بوده است؟ @biologyupdate
آیا کیفیت RNA سنجیده شده است؟
از کدامیک از total RNA و یا Poly(A)RNA در واکنش استفاده شده است؟ معمولا هنگامی که total RNA جواب ندهد Poly(A)RNA جواب خواهد داد. @biologyupdate
آیا در واکنش از کنترل مثبت RNA و پرایمرهای PCR استفاده کرده اید؟
آیا از پرایمرهای gene specific نیز استفاده کرده اید؟@biologyupdate

سوال: در انتهای فرآیند خالص سازی RNA رسوب تشکیل می شود اما دستگاه اسپکتروفوتومتر جذب بسیار پایین و برخی موارد حتی صفر را نشان می دهد. دلیل آن چیست؟
جواب:@biologyupdate
✍✍آیا RNA کاملا حل شده است و یا رسوبات باقی مانده ای در ظرف قابل مشاهده است؟ RNA را تا 42 درجه سانتیگراد حرارت دهید و ورتکس نمایید. رسوبات باقی مانده را با سانتریفیوژ جدا نموده و مجددا جذب آن را بخوانید.

‍ ✍✍✍سوال: بعد از واکنش PCR باند مورد نظر بر روی ژل کمرنگ است. علت چیست؟
آیا از کیفیت RNA و یا DNA خود اطمینان دارید؟ نمونه خود را از نظر سالم بودن، آلوده نبودن با مهارکننده و یا آلودگی بسنجید.
آیا از hot-start PCR هم برای بالا بردن ویژگی (specificity) استفاده کرده اید؟
آیا Tm پرایمرها با یکدیگر همخوانی دارند؟ اگر باند دایمر پرایمر مشاهده می شود بهترین کار استفاده از hot-start PCR است.
آیا سیکل های شما کمتر از حد کافی نمی باشد؟
آیا دمای annealing در شرایط اپتیموم است؟
آیا غلظت Mg2+ در شرایط اپتیموم است؟

بیولوژی Biology:
سوال: چرا PCR من جواب نمی دهد؟!
✍✍جواب: @biologyupdate
آیا در تیوب PCR الگو دارید؟ حتما نیاز به کنترل مثبت از یک یا چند ژن housekeeping دارید. همچنین به دست آوردن طیف دینامیکی تشخیص از طریق منحنی های استاندارد می تواند راهنمای خوبی باشد.
آیا آنزیم شما فعال است؟ بررسی کنترل مثبت راه آسان پاسخ به این سوال است.
آیا پرایمرهای شما خوب طراحی شده اند؟ استفاده از چندین مکان امپلیکون برای طراحی پرایمرها می تواند شانس موفقیت شما را افزایش دهد. @biologyupdate
آیا تکثیر شما کافی بوده است؟ می توانید مقداری از محصول PCR خود را مجددا تکثیر کنید و یا می توانید میزان الگوی اولیه را افزایش دهید و یا همچنین می توانید از nested PCR استفاده کنید. بالا و پایین بردن دمای annealing هم می تواند کمک کننده باشد. @biologyupdate
آیا به ترکیبات بافرهای خود اطمینان کافی دارید؟ استفاده از کنترل مثبت و یا بافرهای از قبل تست شده کمک کننده خواهد بود.
آیا غلظت Mg2+ در شرایط ایده آل است؟ استفاده از غلظت های سریالی Mg2+ پیشنهاد می شود.
آیا واکنش شما از حساسیت کافی برای تشخیص الگو برخوردار است؟ تهیه منحنی استاندارد از کنترل مثبت برای تعیین محدودیت تشخیص پیشنهاد می شود.
لینک عضویت در کانال

 

[ABAN dokht]

بیولوژی Biology:
سوال: در انتهای فرآیند خالص سازی RNA رسوب RNA مشاهده نمی شود، دلیل آن چیست؟

✍جواب:
رسوب RNA وجود دارد ولی شما آن را نمی بینید. @biologyupdate
•
معمولا رسوب هایی که حاوی 0.5 تا 2.0 میکروگرم RNA هستند با چشم غیر مسلح قابل مشاهده خواهند بود. رنگ رسوب معمولا بین شفاف تا شیری رنگ بوده و بسته به نوع روتور سانتریفیوژ شکل رسوب نیز تغییر خواهد کرد. یکی از راه هایی که بتوان رسوب را شناسایی کرد استفاده از رسوب ده های همزمان رنگی (colored coprecipitants) است ولی باید دقت داشت که حتما RNase Free باشند.
یکی دیگر از راه های شناسایی رسوب تخلیه میکروتیوب از محلول رویی می باشد. این کار معمولا باعث شناسایی رسوب در انتها و یا دیواره میکروتیوب می شود.
می توان فرض را بر حضور رسوب قرار داد و کمیت آن را با الکتروفورز، اسپکتروفوتومتر و یا فلوئورومتر سنجید.
• غلظت RNA کمتر از حدی است که بتواند با تکنیک های استاندارد رسوب تشکیل دهد.
می توان با اضافه کردن 50 تا 150 میکروگرم در میلی لیتر گلیکوژن و یا 10 تا 20 میکروگرم در میلی لیتر اکریل آمید خطی به رسوب های به دست آمده از روش salt/ethanol راندمان تشکیل رسوب را افزایش داد. گلیکوژن ظاهرا بر روی سنتز Northern Blot, cDNA و یا PCR اثر مهارکنندگی ندارد ولی ممکن است حاوی DNA باشد و منجر به مشاهده false positive در RT-PCR شود. از طرفی اکریل آمید خطی فاقد اسید نوکلئیک می باشد ولی ماده ای سمی و خطرناک است.
RNA وجود ندارد که بخواهد رسوب تشکیل دهد. @biologyupdate

مشکل نمونه:
آیا نمونه شما از منبعی سالم به دست آمده است؟ آیا نمونه از بافت نکروتیک تهیه شده است؟ (RNA در بافت نکروتیک شروع به تخریب شدن می کند)
آیا میزان نمونه برای روند خالص سازی کافی بوده است؟
مشکل نگهداری:
آیا پس از خالص سازی، نمونه بلافاصله در فریزر قرار گرفته است؟
آیا نمونه در معرض انجماد و یخ زدایی مداوم قرار گرفته است؟
آیا pH نمونه نگهداری شده در فریزر زیر 8.5 بوده است؟ (pH بالای 8.5 باعث از بین رفتن RNA می شود)
مشکل جداسازی:
@biologyupdate
آیا فرآیند جداسازی سریع و کامل بوده است؟
آیا ممکن است اشتباها هنگام دور ریختن مایع رویی رسوب نیز خارج شده باشد؟ استفاده از تیوب های غیر سیلیکونه این احتمال را کاهش می دهد.
ب