Pari_A
کاربر اخراجی
- عضویت
- 2017/02/27
- ارسالی ها
- 2,766
- امتیاز واکنش
- 14,439
- امتیاز
- 746
واکنش زنجیرهای پلیمراز (به انگلیسی: Polymerase Chain Reaction) که مخفف آن PCR میباشد. واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) تکنیکی در زیستشناسی مولکولی است و به منظور تکثیر یک نسخه منفرد یا نسخههای کمی از یک قطعه DNA با توالی خاص به تعداد هزار یا میلیونها نسخه به کار میرود. این تکنیک ابزاری آسان و ارزان قیمت برای تکثیر یک قطعه خاص از DNA است و برای اهدافی همچون تشخیص و نظارت بر بیماریهای ژنتیکی، شناسایی مجرمان (در زمینهٔ پزشکی قانونی) و مطالعه عملکرد یک بخش هدف از DNA مورد استفاده قرار میگیرد.[۱]
واکنش زنجیرهای پلیمراز
این تکنیک در سال ۱۹۸۳ بوسیله کری مالیس ابداع شد[۲][۳]). هماکنون PCR یک تکنیک متداول و اغلب ضروری در آزمایشگاههای بالینی و آزمایشگاههای تحقیقاتی است و در موارد گوناگونی کاربرد دارد.[۴][۵] این کاربردها شامل کلونکردن DNAA برای توالی یابی، فیلوژنی بر پایه DNA، آنالیز عملکرد ژنها، تشخیص بیماریهای ارثی، شناسایی اثر انگشت ژنتیکی (مورد استفاده در علم پزشکی قانونی) و تشخیص عوامل بیماریزا در تستهای نوکلئیک اسید برای تشخیص بیماریهای عفونی است. در سال ۱۹۹۳ مولیس همراه با مایکل اسمیت جایزه نوبل شیمی را برای کار روی PCR دریافت کردند.[۶]
اساس تکنیک PCR چرخههای حرارتی است. این چرخهها شامل چرخههای گرمایی و سرمایی تکراری، ذوب DNA و تکثیر آنزیمی DNA است. پرایمرها (قطعات کوتاه DNAA) که حاوی توالی مکمل ناحیه هدف اند به همراه یک DNA پلیمراز، اجزای اصلی واکنش PCR برای انتخاب و تکثیر قطعه مورد نظر را تشکیل میدهند. طی فرایند PCR الگوی DNA به صورت لگاریتمی تکثیر میشود و DNA تکثیر شده خود به عنوان الگویی برای همانندسازی استفاده میشود. PCR میتواند به شکل گستردهای برای انجام مراحل مختلف در دستکاریهای ژنتیکی استفاده شود.
تقریباً در تمام کاربردهای PCR از یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند تک پلیمراز (آنزیمی که از باکتریThermus aquaticus جداسازی شده) استفاده میشود. این DNA پلیمراز از یک DNAAی تکرشتهای به عنوان الگو استفاده کرده و با کمک پرایمرها و با بهکارگیری نوکلئوتیدها که بلوکهای ساختاری DNA هستند، یک رشته DNAی جدید میسازد. در اغلب روشهای PCR از چرخههای حرارتی یعنی گرم و سرد کردن متناوب نمونههای PCR طبق مراحل دمایی مشخص استفاده میشود.
در مرحله اول، دو رشتهٔ مارپیچ DNA دورشتهای در یک دمای بالا، در فرآیندی که ذوب DNA نامیده میشود از یکدیگر جدا میشوند. در مرحله دوم، دما پایین آورده شده و و هریک از دورشته DNA به عنوان الگو عمل میکنند. ساخته شدن رشته جدید از روی الگو توسط DNA پلیمراز انجام میشود. پرایمرها بر اساس توالی قطعهای از DNA که موردنظر ماست طراحی میشوند.
اصول
PCR یک ناحیه خاص از رشته DNA هدف را تکثیر میکند. بهطور معمول اکثر روشهای PCR این قابلیت را دارند تا قطعات DNA بین ۱/۰ و ۱۰ کیلوجفت باز (kbp) را تکثیر کنند. هرچند تکنیکهای دیگر میتوانند قطعاتی با اندازههای بالاتر از ۴۰ کیلوجفت باز را نیز تکثیر کنند.[۷] مقدار تکثیر محصول بوسیله سوبسترای موجود در واکنش که پیشرفت واکنش را محدود میکند تعیین میشود.[۸]
یک واکنش PCR پایهای نیازمند چندین جزء است.[۹] این اجزاء شامل موارد زیر است:
واکنش زنجیرهای پلیمراز
این تکنیک در سال ۱۹۸۳ بوسیله کری مالیس ابداع شد[۲][۳]). هماکنون PCR یک تکنیک متداول و اغلب ضروری در آزمایشگاههای بالینی و آزمایشگاههای تحقیقاتی است و در موارد گوناگونی کاربرد دارد.[۴][۵] این کاربردها شامل کلونکردن DNAA برای توالی یابی، فیلوژنی بر پایه DNA، آنالیز عملکرد ژنها، تشخیص بیماریهای ارثی، شناسایی اثر انگشت ژنتیکی (مورد استفاده در علم پزشکی قانونی) و تشخیص عوامل بیماریزا در تستهای نوکلئیک اسید برای تشخیص بیماریهای عفونی است. در سال ۱۹۹۳ مولیس همراه با مایکل اسمیت جایزه نوبل شیمی را برای کار روی PCR دریافت کردند.[۶]
اساس تکنیک PCR چرخههای حرارتی است. این چرخهها شامل چرخههای گرمایی و سرمایی تکراری، ذوب DNA و تکثیر آنزیمی DNA است. پرایمرها (قطعات کوتاه DNAA) که حاوی توالی مکمل ناحیه هدف اند به همراه یک DNA پلیمراز، اجزای اصلی واکنش PCR برای انتخاب و تکثیر قطعه مورد نظر را تشکیل میدهند. طی فرایند PCR الگوی DNA به صورت لگاریتمی تکثیر میشود و DNA تکثیر شده خود به عنوان الگویی برای همانندسازی استفاده میشود. PCR میتواند به شکل گستردهای برای انجام مراحل مختلف در دستکاریهای ژنتیکی استفاده شود.
تقریباً در تمام کاربردهای PCR از یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند تک پلیمراز (آنزیمی که از باکتریThermus aquaticus جداسازی شده) استفاده میشود. این DNA پلیمراز از یک DNAAی تکرشتهای به عنوان الگو استفاده کرده و با کمک پرایمرها و با بهکارگیری نوکلئوتیدها که بلوکهای ساختاری DNA هستند، یک رشته DNAی جدید میسازد. در اغلب روشهای PCR از چرخههای حرارتی یعنی گرم و سرد کردن متناوب نمونههای PCR طبق مراحل دمایی مشخص استفاده میشود.
در مرحله اول، دو رشتهٔ مارپیچ DNA دورشتهای در یک دمای بالا، در فرآیندی که ذوب DNA نامیده میشود از یکدیگر جدا میشوند. در مرحله دوم، دما پایین آورده شده و و هریک از دورشته DNA به عنوان الگو عمل میکنند. ساخته شدن رشته جدید از روی الگو توسط DNA پلیمراز انجام میشود. پرایمرها بر اساس توالی قطعهای از DNA که موردنظر ماست طراحی میشوند.
اصول
PCR یک ناحیه خاص از رشته DNA هدف را تکثیر میکند. بهطور معمول اکثر روشهای PCR این قابلیت را دارند تا قطعات DNA بین ۱/۰ و ۱۰ کیلوجفت باز (kbp) را تکثیر کنند. هرچند تکنیکهای دیگر میتوانند قطعاتی با اندازههای بالاتر از ۴۰ کیلوجفت باز را نیز تکثیر کنند.[۷] مقدار تکثیر محصول بوسیله سوبسترای موجود در واکنش که پیشرفت واکنش را محدود میکند تعیین میشود.[۸]
یک واکنش PCR پایهای نیازمند چندین جزء است.[۹] این اجزاء شامل موارد زیر است:
- دی ان ای الگو که حاوی ناحیه DNA ی هدف برای تکثیر است.
- تگ پلیمراز که یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت است[۱۰]
- دو پرایمر DNA که مکمل انتهای ۳’ رشتههای سنس و آنتی سنس DNA ی الگو هستند (بدون پرایمرها، جایگاه آغاز دورشتهای که DNA پلیمراز بتواند به آن متصل شود شناخته نمیشود).[۱۱] پرایمرهای خاصی که مکمل DNAA هدف هستند از قبل انتخاب شده و به شکل سفارشی در آزمایشگاه ساخته یا از تأمین کنندگان خریداری میشوند.
- دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته یا dNTPs بلوکهای ساختاری هستند که DNA پلیمراز با استفاده از آنها رشتههای جدید را میسازد.
- یک محلول بافری که محیط شیمیایی مناسبی برای بهبود فعالیت و پایداری DNA پلیمراز فراهم میکند.
- کاتیونهای دوظرفیتی مانند منیزیوم (Mg) یا منگنز (Mn)؛ کاتیون Mg2+ متداولتر است. همچنین کاتیون Mn2+ میتواند برای جهش زایی DNA ی حاصل از PCR استفاده شود و غلظت بالای این یون نرخ خطا را در طول سنتز افزایش میدهد.[۱۲]
- کاتیونهای تک ظرفیتی، معمولاً یونهای پتاسیم (K)
- بافر 10X