Pari_A
کاربر اخراجی
- عضویت
- 2017/02/27
- ارسالی ها
- 2,766
- امتیاز واکنش
- 14,439
- امتیاز
- 746
توالییابی سنگر یکی از روشهای توالییابی دی ان ای بر پایه خاتمه رشته دی اکسی نوکللئوتاید توسط دی ان ای پلیمراز در فرایند همانندسازی دی ان ای است که شرکت Applied Biosystems برای اولین بار تجاری کرد. فردریک سنگر و همکارانش در سال ۱۹۷۷۷ این روش را ابداع کردند و پرکاربردترین روش برای تقریباً ۳۹۹ سال است. اخیراً توالییابی به روش «ژن-بعدی» جایگزین توالییابی به روش سنگر برای حجم بالاتر و تحلیل ژنوم خودکار شده است. اما روش سنگر کماکان کاربرد زیادی در پروژههای کوچکتر، درستیسنجی نتایج ژن-بعدی دارد.
روش توالییابی سنگر (خاتمه زنجیره) برای دیانای.
روش
روش قدیمی خاتمه زنجیره دی ان ای نیاز به یک دیانای تکرشتهای، یک دیانای پرایمر، دیانای پلیمراز، دیاکسینوکلئوسایدتریفسفات (dNTPها) و دیدیاکسینوکلئوسایدتریفسفات تغییریافته دارد که دومی باعث میشود رشته دیانای طولانی نشود. این نوکلئوتایدهای خاتمهبخش یک گروه ۳'-OH که برای تشکیل پیوند فسفدیسیته بین دو نوکلئوتاید مورد نیاز است را کم دارند که سبب میشود دیانای پلیمراز پس از استفاده از ddNTP تکثیر را متوقف کند. این ddNTPss ممکن است به صورت رادیواکتیو یا فلئورسانت برای تشخیص در ماشینهای خودکار برچسبگذاری شدهاند.
نمونه دیانای به چهار واکنش مجزا نقسیم میشود که هر چهار دئوکسینوکلئوتاید نرمال (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) و دیانای پلیمراز را دارد. در هر واکنش تنها یکی از دیدئوکسینوکلئوتایدها(ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP) و باقی از نوکلئوتایدهای عادی افزوده میشود. دیدئوکسینوکلئوتاید افزوده شده باید ۰٫۰۱ غلظت دئوکسینوکلئوتاید متناظر را داشته باشد تا هم تعداد بخشهای مناسبی از تمامی رشته تولید شود.[۲] به بیان دیگر ۴ واکنش برای آزمون هر چهار ddNTP نیاز است. پس از آن بخشهای دیانای حاصل حرارت دِناتوره میشوند و براساس اندازه توسط ژل پلی آکریل آمید-اوره جدا میشوند.
بخشی از یک توالییابی برچسب گذاری شده رادیواکتیوی
در تصویر راست، فیلم اشعه ایکس به ژل تابانده شده است و نقاط سیاه بیانگر قسمتهای دیانای با اندازه مختلف هستند. هر خط سیاه بیانگر بخشی از دیانای است که به علت قرارگیری دیدئوکسینوکلئوتایدها(ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP) به اتمام رسیده است. از مکان نسبی نوارهای مختلف میتوان برای خواندن رشته دیانای استفاده کرد.
قطعات DNA با برچسب رادیواکتیو یا فلورسنت روی پرایمر (۱) در DNA جدید رشته با برچسب dNTP یا با یک برچسب ddNTP.
گونههای محتلف توالییابهای خاتمه زنجیرهای شامل برچسب زدن با نوکلئوتید حاوی فسفر رادیو اکتیو برایبرچسبگذاری ایزوتوپی یا با استفاده از پرایمر نشاندار در سر ۵' با رنگ فلورسنت هستند. پرایمر رنگی امکان تعیین توالی در یک سیستم نوری به صورت سریع تر و مقرون به صرفه تر را فراهم میآورد. لروی هود و همکاران بهبود بعدی را را در ddNTPssهای برچسبگذاری شده داده و آغازگر مرحله توالییابی با توان بالا و خودکار بودند. در این روش در ابتدا از مواد رادیو اکتیو استفاده میشد و بعدها شرکت فارمسیا (سوئد) در دستگاه تعیین توالی نیمه اتوماتیک ALF از تک رنگفلوئورسین (Fluorescein) و در دستگاه ALF Express از رنگ CY5 استفاده کرد. در هر دو دستگاه لازم بود نمونهها درچهار خانه جداگانه ریخته شود و جداسازی با استفاده از ژل اکریل آمید انجام میشد.
روش توالییابی سنگر (خاتمه زنجیره) برای دیانای.
روش
روش قدیمی خاتمه زنجیره دی ان ای نیاز به یک دیانای تکرشتهای، یک دیانای پرایمر، دیانای پلیمراز، دیاکسینوکلئوسایدتریفسفات (dNTPها) و دیدیاکسینوکلئوسایدتریفسفات تغییریافته دارد که دومی باعث میشود رشته دیانای طولانی نشود. این نوکلئوتایدهای خاتمهبخش یک گروه ۳'-OH که برای تشکیل پیوند فسفدیسیته بین دو نوکلئوتاید مورد نیاز است را کم دارند که سبب میشود دیانای پلیمراز پس از استفاده از ddNTP تکثیر را متوقف کند. این ddNTPss ممکن است به صورت رادیواکتیو یا فلئورسانت برای تشخیص در ماشینهای خودکار برچسبگذاری شدهاند.
نمونه دیانای به چهار واکنش مجزا نقسیم میشود که هر چهار دئوکسینوکلئوتاید نرمال (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) و دیانای پلیمراز را دارد. در هر واکنش تنها یکی از دیدئوکسینوکلئوتایدها(ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP) و باقی از نوکلئوتایدهای عادی افزوده میشود. دیدئوکسینوکلئوتاید افزوده شده باید ۰٫۰۱ غلظت دئوکسینوکلئوتاید متناظر را داشته باشد تا هم تعداد بخشهای مناسبی از تمامی رشته تولید شود.[۲] به بیان دیگر ۴ واکنش برای آزمون هر چهار ddNTP نیاز است. پس از آن بخشهای دیانای حاصل حرارت دِناتوره میشوند و براساس اندازه توسط ژل پلی آکریل آمید-اوره جدا میشوند.
بخشی از یک توالییابی برچسب گذاری شده رادیواکتیوی
در تصویر راست، فیلم اشعه ایکس به ژل تابانده شده است و نقاط سیاه بیانگر قسمتهای دیانای با اندازه مختلف هستند. هر خط سیاه بیانگر بخشی از دیانای است که به علت قرارگیری دیدئوکسینوکلئوتایدها(ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP) به اتمام رسیده است. از مکان نسبی نوارهای مختلف میتوان برای خواندن رشته دیانای استفاده کرد.
قطعات DNA با برچسب رادیواکتیو یا فلورسنت روی پرایمر (۱) در DNA جدید رشته با برچسب dNTP یا با یک برچسب ddNTP.
گونههای محتلف توالییابهای خاتمه زنجیرهای شامل برچسب زدن با نوکلئوتید حاوی فسفر رادیو اکتیو برایبرچسبگذاری ایزوتوپی یا با استفاده از پرایمر نشاندار در سر ۵' با رنگ فلورسنت هستند. پرایمر رنگی امکان تعیین توالی در یک سیستم نوری به صورت سریع تر و مقرون به صرفه تر را فراهم میآورد. لروی هود و همکاران بهبود بعدی را را در ddNTPssهای برچسبگذاری شده داده و آغازگر مرحله توالییابی با توان بالا و خودکار بودند. در این روش در ابتدا از مواد رادیو اکتیو استفاده میشد و بعدها شرکت فارمسیا (سوئد) در دستگاه تعیین توالی نیمه اتوماتیک ALF از تک رنگفلوئورسین (Fluorescein) و در دستگاه ALF Express از رنگ CY5 استفاده کرد. در هر دو دستگاه لازم بود نمونهها درچهار خانه جداگانه ریخته شود و جداسازی با استفاده از ژل اکریل آمید انجام میشد.