معرفی روش SDS PAGE

[ABAN dokht]

معرفی روش SDS PAGE

SDS-PAGE تکنیکی است که در آن مولکولهای زیستی بر اساس اندازه جداسازی می شود . مولکولهایی چون انواع پروتئین ها , RNA , DNA . ژل آگاروز برای درشت مولکولهایی مانند DNA بهترین گزینه است . SDS-PAGE برای پروتئین های کوچکتر بهتر است .


مواردی که SDS-PAGE کاربرد دارد عبارت است از :

۱- تصدیق اندازه پروتئین ها

۲- شناسایی پروتئین ها

۳- تعیین خلوص پروتئین ها

۴- شناسایی پیوند های دی سولفید

۵- کمیت و مقدار پروتئین ها

۶- آشکار کردن عیوب

SDS یک دترجنت و مخفف sodium dodecyl sulfate می باشد . بعد از اضافه کردن آن , و احاطه کردن پروتئین ها , پروتئین ها بار نسبتا همسان پیدا کرده و به صورت خطی در می آیند . بدین ترتیب جداسازی فقط بر اساس اندازه صورت می پذیرد . تعداد مولکولهای SDS متناسب با تعداد آمینواسیدهای یک پروتئین است . هر مولکول SDS دو بار منفی به پروتئین می دهد . همچنین باعث می شود که نیرو هایی که در تا شدن و تغییر شکل دادن پروتئین ها شرکت می کنند , از بین بروند .

ژل پلی اکریل آمید همانند ژل آگاروز بر اساس اندازه مولکولها , جداسازی می کند . ژل اکریل آمید با پیوندهای عرضی که دارد , مکانی را برای الک کردن مولکولهایی که در اثر جریان الکتریکی در حال عبور می باشند , به وجود می آورد . همه پروتئین هایی که دارای بار منفی هستند , توسط انتهای میدان الکتریکی که دارای بار مثبت می باشد , کشیده می شود , اما شبکه پلیمری در برابر حرکت آنها مقاومت می کند . پروتئین های کوچکتر سریعتر از مولکولهای درشت تر در این شبکه , حرکت می کنند . در نتیجه از مولکولهای درشت تر پایین تر قرار می گیرند . پس جداسازی در روش SDS-PAGE فقط بر اساس اختلاف در اندازه مولکولها می باشد .

پس از اینکه ژل Run شد , شما احتیاج دارید که پروتئین ها را بر روی ژل فیکس کنید . تا پروتئین ها از جای خود حرکت نکند . اسید استیک 25% یک فیکس کننده خوب است و باعث دناتوره شدن پروتئین می گردد .

ژل توسط یک رنگ مثل coomasie blue R250 رنگ می شود .
رنگ و تثبیت کننده را می توان در یک محلول که حلال آن متانول است به طور همزمان استفاده کرد .
رنگ در کل ژل پخش شده و با پروتئین ها کمپلکس می شود(staining) .

سپس با یک محلول که حاوی اسید استیک و متانول است ژل شسته می شود تا رنگ از ژل خارج شود و فقط رنگی که با پروتئین ها باند شده است باقی بماند (destain).
بدون SDS , پروتئین با ساختمان اولیه خود و بدون تغییر بار جداسازی می شود , که در این روشجرم مولکولی و بار isoelectric در جداسازی تآثیر گذار است و این روش PAGE نام دارد . SDS تقریبا به نسبت 1.4g برای هر یک گرم پروتئین استفاده می شود .
(این نسبت بین 1.1g الی 2.2g SDS برای هر گرم پروتئین تغییر می کند) .

اندازه منافذ SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis :
بیشتر پروتئین ها و نوکلوئیک اسیدها با اندازه و شکل های متفاوت دارای ضریب بار/جرم تقریبا یکسانی هستند . الکتروفورز این مولکولها در محیط مایع , باعث جداسازی مناسبی نمی شود .
اما الکتروفورز در محیط ژل (سوسپانسیون نیمه جامد در آب) نتیجه بهتری می دهد . جداسازی پروتئین ها بطور معمول در ژلهای پلی اکریل آمید انجام می شود .

این ژل ها توسط پلیمره شدن محلولی از مونومر اکریل آمید که قالب آن از دو شیشه تشکیل شده است , درست می شود . میزان درشتی و ریزی منفذهای پلیمر متناسب است با غلظتپلی اکریل آمید و عامل بوجود آورنده پیوند های عرضی.
وقتی یک مخلوط از پروتئین در ژل و در میدان الکتریکی ایجاد شده قرار می گیرد , پروتئین های کوچکتر سریعتر از درشت مولکولها از میان منافذ ژل حرکت می کنند . میزان جابجایی به اندازه منافذ ژل و قدرت میدان الکتریکی بستگی دارد . پس مولکولهای کوچکتر راحت تر از منافذ عبور کرده , در حالی که درشت مولکولها به راحتی جابجا نمی شوند .
در این متد مخلوط پروتئین و SDS که یک دترجنت آنیونی است , توسط گرما با هم باند شده اند . لذا پروتئین ها دیگر ساختمان اولیه را ندارند و فاقد پیوندهای دی سولفید هستند .

ردیابی رنگ در الکتروفورز :

رنگ به کار رفته در محلول پروتئین به آزمایش کننده این امکان را می دهد که متوجه شود پروسه چه میزان پیش رفته است و آیا مدت زمان جداسازی کافی بوده است یا خیر .



عناصر سازنده شیمیایی و نقش آنها

 

[ABAN dokht]

تازه های زیست شناسی:
اندازه منافذ را 2 فاکتور کنترل می کند .(T%) مقدار درصد acrylamide و مقدار پیوندهای عرضی (C%) . کل غلظت مونومر acrylamide-bisacrylamide = T و غلظت عامل پیوند دهنده عرضی = C . اندازه منافذ با افزایش T% کاهش می یابد و با عامل پیوند دهنده عرضی 5% کوچکترین اندازه منفذ را می دهد . هرگونه افزایش و یا کاهشی در C% باعث افزایش اندازه منفذ می شود , زیرا رابـ ـطه اندازه منفذ با C% یک رابـ ـطه پارابولیک (سهمی گونه) است . و مینیمم آن در 5% می باشد . دو لایه در ژل وجود دارد :
یکی stacking و دیگری separating .



محلولها در SDSPAGE :

محلول استوک آکریل آمید :

آکریل آمید : 73.0g

بیس آکریل آمید : 2.0g

مواد ذکر شده را در 250ml آب مقطر حل نمایید . این محلول در یک شیشه قهوه ای (تیره) و در دمای 4c هفته ها قابل استفاده می باشد .

استوک بافر ژل جدا کننده :

SDS : 1.0g

تریس : 45.5g

مواد ذکر شده را در کمتر از 250ml آب مقطر حل نمایید . pH را به 8.8 برسانید . سپس حجم را به 250ml برسانید .این محلول در دمای 4c ماه ها قابل استفاده می باشد .


استوک بافر ژل متراکم کننده :

SDS : 1.0g

تریس : 15.1g

مواد ذکر شده را در کمتر از 250ml آب مقطر حل نمایید . pH را به 6.8 برسانید . سپس حجم را به 250ml برسانید .این محلول در دمای 4c ماه ها قابل استفاده می باشد .

محلول استوک آمونیوم پر سولفات :

آمونیوم پر سولفات: 1.0g


ماده ذکر شده را در 10ml آب مقطر حل نمایید. این محلول در یک شیشه قهوه ای (تیره) و به صورت تازه مصرف شود . پیشنهاد اینجانب این است که در 10 میکروتیوب تقسیم شده و در فریزر نگهداری شود و جهت استفاده یکی از آنها را در آورده ، در یک نوبت مصرف نمایید .
بافر مخزن :

SDS : 2.0g

تریس : 6.0g

گلایسین : 28.8g

مواد ذکر شده را در کمتر از 2L آب مقطر حل نمایید . pH را به 8.3 برسانید . سپس حجم را به 2L برسانید .این محلول باید به صورت تازه مصرف شود .

استوک Sample بافر :

SDS : 0.92g

تریس : 0.3g

گلیسرول : 4.0g

برومو فنول بلو : 0.1 % (w/v )

بتا – مرکاپتو اتانول : 2.0ml

مواد ذکر شده را در کمتر از 20ml آب مقطر حل نمایید . pH را به 6.8 برسانید . سپس حجم را به 20ml برسانید .این محلول در دمای 4c هفته ها قابل استفاده می باشد .

محلول رنگ آمیزی :

کماسی بلو G-250 : 0.5g

متانول : 12.5ml

استیک اسید : 18.75ml

ابتدا رنگ را در متانول حل نمایید . سپس اسید استیک اضافه کنید و با آب مقطر به حجم 250ml برسانید .

محلول رنگ بر :

متانول : 100ml

استیک اسید : 100ml

آب مقطر : 800ml


محلول را به صورت تازه استفاده نمایید .
روش رنگ آميزی کوماسی بلو (کلوئيدی)


اين روش درکمتر از 2 ساعت پروتئين ها را در يک زمينه تميز و با حساسيتی درحدود روش نقره رنگ آميزی می کند. افزودن اتانول و سولفات آمونيوم به محلولی از آبی کوماسی G-250 در اسيد فسفريک رقيق، رنگ مذکور را به سمت شکل کلوئيدی آن سوق می دهد. در طی رنگ آميزی ، تعادلی بين اشکال کلوئيدی وفرم پراکنده مولکولی رنگ وجود دارد . فرم پراکنده رنگ وارد ماتريکس ژل شده و پروتئين ها را رنگ می کند. در حالی که فرم کلوئيدی بيرون نگه داشته می شود و به اين ترتيب از رنگ آميزی زمينه پرهيز می شود.


تهیه 1000ml محلول رنگ آمیزی :

100ml از محلول آمونیوم سولفات 10% , 20ml از محلول کوماسی بلو 0.1% , 30ml از محلول اورتو فسفریک اسید 3% , 200ml از محلول اتانول 20% , 650ml آب مقطر

نحوه رنگ آمیزی :

1- پس از الکتروفورز، ژل را 2 بار به مدت 3min در آب مقطر , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید.

2- ژل را در محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو کلوئيدی به مدت 2 ساعت قرار دهید .

3- باندها باید بدون رنگ زدایی دیده شوند , اما می توانید با آب مقطر نیز رنگ زدایی کنید .

نکات مهم :

1- محلول رنگ را پيش از استفاده نبايد صاف کرد .

2- بلافاصله بعد از رنگ آمیزی با این روش از ژل مورد نظر عکس برداری شود ، زیرا پایداری رنگ آمیزی با این روش کم است (حدود یک الی دو ساعت).

روش رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره (آمونیاکی)

این روش از سایر رنگ آمیزی ها بسیار حساس تر است . باندی که در روش کوماسی بلو ممکن است دیده نشود ، در این روش به سادگی دیده می شود .

محلول های مورد نیاز برای رنگ آمیزی :

(1): محلول ثبوت یک: 100ml محلول TCA (تری کلرواستیک اسید 20 %)

(2): محلول ثبوت دو : 40ml اتانول و 10ml اسید استیک را توسط آب مقطر به حجم 100ml برسانید.

(3): محلول گلوتار آلدهید 10%: 20ml از محلول استوک 50% گلوتار آلدهید را با آب مقطر به حجم 100ml برسانید.(به علت گرانی این ماده می توان از محلول رقیق تر استفاده کرد ولی زمان بیشتری را در نظر گرفت )

 

[ABAN dokht]

(4): محلول رنگ آمیزی (محلول نقره آمونیاکی): 21ml محلول هیدروکسید سدیم 0.36% و 1.95mlمحلول آمونیاک 25% را در یک ارلن بریزید. سپس در یک لوله آزمایش ، 0.8g نیترات نقره و 4ml آب مقطر ریخته ، حل می کنیم . محلول نیترات نقره را ، قطره قطره به محتویات ارلن اضافه کنید.در صورت دیدن رسوب قهوه ای ، به آن دو قطره آمونیاک اضافه کنید و ظرف را تکان دهید تا محلول شفاف شود . حجم نهایی را به 100ml برسانید.

(5): محلول ظهور : 10mg اسید سیتریک و 0.1ml فرمالدهید (35%) را به حجم 200ml برسانید .

(6): محلول متوقف کننده : محلول متوقف کننده همان محلول ثبوت دو (2) می باشد .

مراحل رنگ آمیزی :

1- ابتدا ژل را توسط آب مقطر و درون ظرفی که روی شیکر قرار دارد به مدت 5 دقیقه بشویید.

2- اب مقطر را از ظرف خارج نمایید .

3- محلول ثبوت (1) را روی ژل ریخته ، جوری که روی آن را بپوشاند. به مدت 20 الی 30 دقیقه آن را شیک نمایید.

4- محلول ثبوت (1) را خارج کرده ، محلول ثبوت (2) را به ظرف اضافه نمایید . 20 دقیقه آن را شیک نمایید.

5- ژل را 2 بار و هر بار به مدت 5 الی 10 دقیقه با آب مقطر فراوان شیک نموده ، تا خوب شسته شود .

6- 100ml محلول گلوتارآلدهید را به ظرف اضافه کرده ، به مدت 20 الی 30 دقیقه آن را شیک نمایید.

7- پس از خارج کردن محلول ، ژل را 4 بار ، هر بار به مدت 5 دقیقه ، توسط آب مقطر شیک نمایید و بشویید.

8- محلول رنگ آمیزی را به ظرف اضافه کرده ، آن را به مدت 30 دقیقه شیک نمایید.

9- پس از خارج کردن محلول ، ژل را 3 بار ، هر بار به مدت 5 دقیقه ، توسط آب مقطر شیک نمایید و بشویید.

10- 100ml محلول ظهور را به ظرف اضافه کرده ، ظرف را تا ظهور باندها ، بسیار آرام تکان دهید.

11- پس از ظهور باندها به صورت مطلوب ، قبل از تیره شدن زمینه ژل ، محلول ظهور را به سرعت خارج کرده ، محلول متوقف کننده را اضافه نمایید.

روش رنگ آميزی ايميدازول – روی
اين روش رنگ آميزی به حساسيت روش نقره است و تنها یک ساعت طول می کشد. این روش رنگ آميزی نگاتيو است که در آن زمينه ژل به جاي پروتئين ها رنگ می شود. رنگ به صورت کمپلکسي از "SDS" و ايميدازول روی و به رنگ سفید کدر در ژل رسوب ميکند . مناطقی از ژل که حاوی پروتئين هستند ،شفاف باقی می مانند . برهم کنشی بين رنگ و پروتئين وجود ندارد ودر صورت نياز، ژل را کاملاٌ می توان رنگ زدايی کرد . اين روشها را برای ژلهای 2 -D آناليتيکال و ژلهای SDS-PAGE هم می توان بکار برد . برای ژلهای نازک تر ( کمتر از يک ميلی متر ) زمان انکوباسيون در روش ايميدازول-روی را می توان کاهش داد . تکه ژلهايی که توسط ايميدازول- روی رنگ آميزی شده اند را می توان توسط اسيد سيتريک 2% رنگ زدايی کرد .

محلول های مورد نیاز :

محلول تثبیت کننده

50%(v/v) متانول , 5%(v/v) اسید استیک گلاسیال , 45%(v/v) آب مقطر

محلول 0.2M سولفات روی (محلول شماره 2)

28.7g سولفات روی در 500ml آب مقطر

محلول 0.2M ایمیدازول , 0.1% SDS (محلول شماره 3)

6.8g ایمیدازول , 500ml , 0.5g SDS آب مقطر

نحوه رنگ آمیزی :

1- بعد از اتمام الکتروفورز , ژل را به مدت 20min در محلول تثبیت کننده غوطه ور نمایید .

2- محلول را دور ریخته و ژل را 2 بار به مدت 15min در آب مقطر , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید .

3- در محلول شماره 3 به مدت 15min و در انکوباتور , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید .

4- محلول شماره 3 را دور ریخته و محلول شماره 2 را به آن اضافه نمایید . 30 الی 60 ثانیه شیک نمایید .

5- وقتی رنگ رضایت بخشی ظاهر شد , می توانید محلول را دور ریخته و به جای آن آب مقطر به ژل اضافه کنید.

در این روش رنگ آمیزی , ژلها اندکی شکننده تر به نظر مي رسند و درصورت نگهداری طولانی مدت مستعد خشک شدن هستند. ضمناً برای مشاهده نياز به زمينة تيره دارند. همچنین می توانید این روش را همراه با روش کوماسی بلو انجام دهید . به نحوی که پس از رنگ آمیزی کوماسی بلو , مراحل 2 تا 5 را انجام دهید .

پلیمریزاسیون ژل آکریل آمید در الکتروفورز

پلیمریزاسیون ژل :

یک رادیکال آزاد که به عنوان یک آغازگر , پلیمریزاسیون ژل آکریل آمید را سبب می شود , از یکی از این دو راه تولید می شود . پروکسید یا روش فوتوشیمی . عمومی ترین روش استفاده از آمونیوم پرسولفات به عنوان یک پروکسید آغازگر است . و از TEMED به عنوان یک تسریع کننده یا (کاتالیزور) استفاده می شود .

 

[ABAN dokht]

برای پلیمریزاسیون به روش فوتوشیمی از ریبوفلاوین riboflavin و اشعه UV به عنوان آغازگر استفاده می شود و از TEMED به عنوان یک کاتالیزور استفاده می شود . به محلول ژل اشعه ماوراء بنفش تابانده می شود . یک لامپ فلورسنت واکنش فوتوشیمی را آغاز خواهد کرد . پلیمریزاسیون به روش فوتوشیمی در مواقعی که باید قدرت یونی در ژل پایین باشد , مورد استفاده قرار می گیرد . زیرا در این روش فقط یک مقدار بسیار جزئی از ریبوفلاوین لازم است . همچنین در مواقعی که پروتئین در مقابل آمونیوم پرسولفات خیلی حساس است یا به وسیله پروکسید وارد پلیمریزاسیون می شود , از این روش استفاده می گردد .

پلیمریزاسیون آکریل آمید یک واکنش گرمازاست . پلیمریزاسیون سریع گرمای زیادی تولید می کند . این امر انتقال برق را در ساختمان ژل ناهمگون می نماید و گاهی باعث شکسته شدن شیشه آن می شود . این مشکل به طور ویژه در ژلهایی با غلظت بالا (>T 20% ) دیده می شود . برای جلوگیری از گرمای زیاد باید غلظت آغازگر – کاتالیزور را طوری تنظیم کرد , که پلیمریزاسیون در مدت 20-60min کامل شود .

منبع:

Please, ورود or عضویت to view URLs content!